人胚肺成纤维细胞复制性衰老过程中端粒相关因子的表达

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2013.28.014

中国组织工程研究 ›› 2013, Vol. 17 ›› Issue (28): 5184-5190.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2013.28.014

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人胚肺成纤维细胞复制性衰老过程中端粒相关因子的表达

杜华¹，徐晓艳¹，海玲¹，师迎旭^{2, 3}

1内蒙古医科大学基础医学院病理解剖学教研室，内蒙古自治区呼和浩特市 010059；
2内蒙古医科大学附属医院临床研究中心，内蒙古自治区呼和浩特市 010050；
3中国医学科学院北京协和医学院血液学研究所，天津市 300020

出版日期:2013-07-09 发布日期:2013-07-09
作者简介:杜华，女，1978年生，山西省忻州市人，汉族，2007年内蒙古医科大学毕业，硕士，讲师，主要从事肿瘤病理方面的研究。 duhua20042007@sina.com 并列第一作者：师迎旭，1978年生，内蒙古自治区集宁市人，汉族，2011年中国医学科学院北京协和医学院血液学研究所毕业，博士，助理研究员，主要从事细胞生物学研究。 shi.yingxu.wolf@gmail.com
基金资助:
内蒙古医科大学资助项目(YKD2012KJBW006)

Telomere-associated factor expression in replicative senescence of human embryonic lung fibroblasts

Du Hua¹, Xu Xiao-yan¹, Hai Ling¹, Shi Ying-xu^{2, 3}

1Department of Pathological Anatomy, School of Basic Medical Sciences, Inner Mongolia Medical University, Hohhot 010059, Inner Mongolia Autonomous Region, China;
2Clinical Research Center, Affiliated Hospital of Inner Mongolia Medical University, Hohhot 010050, Inner Mongolia Autonomous Region, China;
3Institute of Hematology, Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College, Tianjin 300020, China

Online:2013-07-09 Published:2013-07-09
About author:Du Hua, Master, Lecturer, Department of Pathological Anatomy, School of Basic Medical Sciences, Inner Mongolia Medical University, Hohhot 010059, Inner Mongolia Autonomous Region, China duhua20042007@sina.com Shi Ying-xu, M.D., Assistant researcher, Clinical Research Center, Affiliated Hospital of Inner Mongolia Medical University, Hohhot 010050, Inner Mongolia Autonomous Region, China; Institute of Hematology, Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College, Tianjin 300020 China shi.yingxu.wolf@gmail.com Du Hua and Shi Ying-xu contributed equally to this paper.
Supported by:
Funds of Inner Mongolia Medical University, No. YKD2012KJBW006*

摘要/Abstract

摘要：

背景：端粒相关蛋白直接影响端粒的功能，调节端粒DNA的长度，与细胞的衰老和癌变密切相关。

目的：通过观察正常细胞复制性衰老过程中端粒相关因子的变化来找寻细胞正常衰老过程中的关键调控分子。

方法：在构建好的细胞复制性衰老模型基础上，利用RT-PCR与western blot方法在分子与蛋白水平检测端粒相关因子的表达变化，主要检测人胚肺成纤维细胞在复制性衰老过程中端粒相关因子人端粒结合蛋白1、端锚聚合酶1、端粒酶RNA、端粒末端保护蛋白1以及P53的表达情况。

结果与结论：结果显示，随着细胞的衰老，人端粒结合蛋白1的转录水平未发生改变，而人端粒结合蛋白1的蛋白表达水平有逐渐升高而后快速降低的过程；端锚聚合酶1的mRNA水平及蛋白表达水平未发生变化；端粒末端保护蛋白1随着人胚肺成纤维细胞的衰老表达水平逐渐降低；端粒酶RNA组分随着细胞的衰老呈递增趋势；P53的蛋白表达未发生变化。综上认为，人端粒结合蛋白1、端粒末端保护蛋白1及端粒酶RNA在细胞的复制性衰老过程中起重要作用。

关键词: 组织构建, 组织构建与生物活性因子, 复制性衰老, 端粒结合蛋白1, 端锚聚合酶1, 端粒末端保护蛋白1, 端粒酶RNA, P53, 其他基金

Abstract:

BACKGROUND: Telomere-associated proteins will directly affect the function of telomeres, adjust the length of telomeric DNA, which are closely related with cell senescence and carcinogenesis.
OBJECTIVE: To find the key regulatory molecules in the cell senescence process through observing the telomere-associated factor expression in normal cell replicative senescence process.
METHODS: Based on established cell replicative senescence model, reverse transcription-PCR and western blot were used to detect the telomere-associated factor expression on the molecular and protein levels, including the telomere-associated factor human telomere binding protein 1, tankyrase 1, telomerase RNA, telomere protection protein 1 and P53 expressions in the human embryonic lung fibroblast replicative senescence.
RESULTS AND CONCLUSION: The results showed that with the cell senescence, transcription of human telomere binding protein 1 did not changed, while the protein expression of human telomere binding protein 1 was increased gradually and then decreased rapidly; mRNA and protein expressions of telomere protection protein 1 did not changed; with the human embryonic lung fibroblast replicative senescence, expression of telomere protection protein 1 was decreased gradually; with cell senescence, telomerase RNA component showed an increasing trend; protein expression of P53 did not changed. Human telomere binding protein 1, telomere protection protein 1 and telomerase RNA play an important role in cell senescence.

Key words: tissue construction, tissue construction and bioactive factors, replicative senescence, telomere binding protein 1, Tankyrase 1, telomere protection protein 1, telomerase RNA, P53, other grants-supported paper

中图分类号:

R318

杜华，徐晓艳，海玲，师迎旭. 人胚肺成纤维细胞复制性衰老过程中端粒相关因子的表达[J]. 中国组织工程研究, 2013, 17(28): 5184-5190.

Du Hua, Xu Xiao-yan, Hai Ling, Shi Ying-xu. Telomere-associated factor expression in replicative senescence of human embryonic lung fibroblasts[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2013, 17(28): 5184-5190.

图/表（结果） 4

2.1 Western blot检测结检测人端粒结合蛋白1、端锚聚合酶1与端粒末端保护蛋白1 3种蛋白在细胞复制性衰老过程中的变化情况 见图1。通过检测发现衰老过程中不同代龄的人胚肺成纤维细胞中人端粒结合蛋白1的mRNA表达水平没有明显的变化，见图1A。表明人端粒结合蛋白1的转录水平在细胞复制性衰老过程中没有发生变化，说明细胞正常衰老的发生不会影响人端粒结合蛋白1基因的表达。端锚聚合酶1调节人端粒结合蛋白1与端粒的结合，通过检测衰老过程中不同代龄的人胚肺成纤维细胞发现端锚聚合酶1的mRNA表达水平没有明显变化，见图1B。表明端锚聚合酶1的转录水平在细胞复制性衰老过程中没有发生变化，说明细胞正常衰老的发生不会影响端锚聚合酶1基因的表达。端粒末端保护蛋白1是维护端粒突出端的重要蛋白。端粒末端保护蛋白1的mRNA在所有组织中都存在，缺少端粒末端保护蛋白1的细胞会由于染色体末端的融合而死亡，这说明端粒末端保护蛋白1是确保染色体末端完整的管家基因。端粒末端保护蛋白1有5种剪接体，4种是普遍表达的，其中剪接体1，2，3，4在各种正常组织与肿瘤组织中都有大量表达，而剪接体5只在外周血白细胞中表达。端粒末端保护蛋白1剪接体2缺失exons 12a，剪接体5缺失exons 15a，如存在剪接体2与5，通过RT-PCR扩增exons 12-16应得到3条带，由上至下依次为端粒末端保护蛋白1、剪接体5、剪接体2。

通过检测衰老过程中不同代龄的人胚肺成纤维细胞端粒末端保护蛋白1及其剪接体的mRNA表达水平发现端粒末端保护蛋白1的mRNA表达水平随着细胞的衰老呈递减趋势，见图1C，而且人胚肺成纤维细胞不仅不含有剪接体5还不含有剪接体2。端粒末端保护蛋白1 mRNA表达水平随着细胞的衰老递减，表明端粒末端保护蛋白1与衰老负相关。说明细胞的衰老过程可以阻碍端粒末端保护蛋白1的表达，从而使端粒的末端的3’悬突暴露加剧端粒的不稳定性。 2.2 RT-PCR方法检测人端粒结合蛋白1、端锚聚合酶1与端粒末端保护蛋白1在复制性衰老过程中的基因表达情况 见图2。

研究发现细胞的衰老伴随着端粒末端保护蛋白1的低表达，端粒末端保护蛋白1低表达可能是细胞复制性衰老的一个检测标志。人端粒结合蛋白1与端锚聚合酶1的在基因水平未发生变化，进一步检测了它们的蛋白表达情况。通过检测衰老过程中不同代龄人胚肺成纤维细胞发现人端粒结合蛋白1的蛋白表达水平随细胞的衰老呈增加的趋势，见图2A。表明人端粒结合蛋白1的蛋白表达量与衰老正相关。图2A中PD59的人端粒结合蛋白1低表达，推测是因为此时细胞开始进入细胞死亡阶段。前期细胞想通过高表达人端粒结合蛋白1来阻止细胞的衰老进程，但在细胞端粒不断缩短后，接近“Hayflick”极限，细胞启动凋亡机制，便不再高表达人端粒结合蛋白1的蛋白。通过检测衰老过程中不同代龄人胚肺成纤维细胞发现端锚聚合酶1的蛋白表达水平没有明显的变化，见图2B。表明端锚聚合酶1的蛋白水平在细胞复制性衰老过程中没有发生变化。端锚聚合酶1调节人端粒结合蛋白1与端粒DNA的结合，在细胞复制性衰老过程中未发生改变，说明端锚聚合酶1并未参与正常的衰老过程，可能只是在延长端粒或细胞复制过程中起作用。 2.3 端粒酶RNA在细胞衰老中的表达 端粒酶RNA在1995年被发现，在各种细胞中普遍存在，且含量恒定。正常细胞无端粒酶活性但表达端粒酶RNA，端粒酶RNA会对细胞的复制性衰老起作用吗？实验通过检测衰老过程中不同代龄的人胚肺成纤维细胞端粒酶RNA的表达水平发现其mRNA表达水平随着细胞的衰老呈递增趋势，见图3。表明端粒酶RNA可能也参与细胞的复制衰老过程。说明衰老过程对于细胞造成巨大的生存压力，细胞为了缓解由于端粒丢失造成的应激，会激活促进端粒酶RNA的表达。

2.4 P53蛋白在细胞衰老中的表达 最近大量研究涉及P53诱导细胞衰老作用，人们积极探讨P53诱导细胞衰老的基因机制。有研究表明P53能够加速衰老，因此作者检测衰老过程中不同代龄人胚肺成纤维细胞P53的表达发现其蛋白表达水平随着细胞的衰老并未发生变化，见图4。表明P53的蛋白表达水平在细胞复制性衰老过程中没有变化，但其活性是否增高还有待进一步的研究。实验研究了与端粒稳定性密切相关的3个端粒蛋白——人端粒结合蛋白1、端锚聚合酶1与端粒末端保护蛋白1基因与蛋白表达水平与细胞复制性衰老的关系，通过研究发现，细胞的衰老会导致端粒末端保护蛋白1的表达减少，可能是由于细胞的不断衰老端粒的3’悬突变短，端粒末端保护蛋白1结合位点减少，导致端粒末端保护蛋白1的转录下降，从而加剧端粒的不稳定性，细胞衰老过程加快。人端粒结合蛋白1与端锚聚合酶1的基因表达水平未见改变，但人端粒结合蛋白1的蛋白表达明显提高，说明可能是细胞为了提高端粒DNA的稳定性促进了人端粒结合蛋白1的翻译。端粒酶RNA在衰老过程中也高表达，可能与人端粒结合蛋白1蛋白的高表达相类似，是细胞为了阻止衰老带来的应激而产生的应答。有研究发现P53可能促进衰老，但本文没有发现，可能与P53的磷酸化状态有关，仍需要进一步的研究证实。

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引言

细胞衰老问题不仅是一个重大的生物学问题，而且是一个重大的社会问题。细胞衰老是正常环境条件下发生的功能减退，逐渐趋向死亡的现象。通过细胞衰老的研究可了解衰老的某些规律，对认识衰老和最终找到延缓衰老的方法都有重要意义。有许多研究发现细胞复制性衰老与端粒长度密切相关，端粒长度的缩短是造成细胞复制性衰老的原因，而端粒的长度受端粒相关因子的调节。因此，研究端粒相关因子与细胞复制性衰老之间的关系能够揭示细胞衰老机制。人端粒结合蛋白1与端粒末端保护蛋白1是端粒结合蛋白，人端粒结合蛋白1与端粒末端保护蛋白1通过人端粒结合蛋白1相关核蛋白2/端粒末端保护蛋白1，2连接蛋白/端粒末端保护蛋白1-交互作用蛋白相互作用建立联系^[1-4]。Lundblad^[5]认为端粒末端保护蛋白1与ssDNA结合的过程是由人端粒结合蛋白1介导的，在细胞中端粒末端保护蛋白1首先与人端粒结合蛋白1复合物结合，其次由人端粒结合蛋白1感知端粒长度变化，引导端粒末端保护蛋白1与ssDNA结合。有很多实验都证实了端粒末端保护蛋白1确实与人端粒结合蛋白1复合物发生联系^[6-10]，相互作用的核心蛋白为人端粒结合蛋白1、人端粒结合蛋白2、端粒末端保护蛋白1和端粒末端保护蛋白2连接蛋白、端粒末端保护蛋白1、抑制激活蛋白1、人端粒结合蛋白1相关核蛋白2，涉及维护端粒稳定性的两大复合物人端粒结合蛋白1复合物与人端粒结合蛋白2复合物。端锚聚合酶1具有聚腺苷二磷酸核糖基聚合酶活性，通过与人端粒结合蛋白1结合使人端粒结合蛋白1核糖基化，导致人端粒结合蛋白1从端粒上解离。端锚聚合酶1含有5个锚蛋白重复序列，每一个锚蛋白重复序列都可以与人端粒结合蛋白1单独结合，其中锚蛋白重复序列5对于端锚聚合酶1糖基化人端粒结合蛋白1、延长端粒长度很重要^[11-16]。人端粒结合蛋白1、端锚聚合酶1与端粒末端保护蛋白1三者的关系是人端粒结合蛋白1调节端粒末端保护蛋白1与端粒ssDNA的结合过程，端锚聚合酶1调节人端粒结合蛋白1与dsDNA的结合过程。现在人们关于复制性衰老的观点有2种：端粒缩短观点和端粒突出端缩短观点。端粒缩短观点涉及人端粒结合蛋白1与端锚聚合酶1；端粒突出端缩短观点涉及人端粒结合蛋白1与端粒末端保护蛋白1。由此可见这3种蛋白对于细胞复制性衰老起重要作用。在肿瘤细胞与永生化细胞中端粒的长度是维持不变的，研究发现在这些细胞中含有一种酶可使端粒延长，这种酶称作端粒酶。端粒酶是一蛋白复合物，由端粒酶RNA组分、端粒酶催化亚基和端粒酶结合蛋白(包括hEST2、hTEP1、SSB、DKC1等)组成。端粒酶RNA与端粒酶相关蛋白核内不均一核糖核蛋白结合^[17-20]，其CR4-CR5结构域对于端粒酶RNA与端粒酶相关蛋白结合十分重要，这表明端粒酶RNA可能参与端粒长度的调控，也可能与细胞复制性衰老相关^[21-26]。 p53是一个肿瘤抑制基因，是重要的细胞周期与细胞凋亡的调控基因之一。p53还是细胞衰老过程中的重要的调节因子，能感知衰老相关信号的刺激，如端粒的缩短、DNA损伤或肿瘤抑制基因的过表达。研究发现，p53与Rb共同维持细胞的生长抑制状态。p53活性降低可延迟细胞的复制性衰老，但不能阻止细胞衰老^[27-28]。ATM/p53/p21途径中，p53通过诱导p21^WAF-1表达从而使衰老细胞生长抑制，p21^WAF-1的表达与p53的活性正相关。通过观察分析正常细胞复制性衰老过程中端粒相关因子人端粒结合蛋白1、锚聚合酶1、端粒末端保护蛋白1以及端粒酶RNA、p53的表达变化，将为进一步探究正常情况下细胞衰老的机制提供理论基础。

材料方法

设计：细胞学及分子生物学检测实验。

时间及地点：于2004年3月至2005年7月在北京军事医学科学院放射与辐射医学研究所全军生化重点实验室初次完成；于2011年9月至2012年7月在内蒙古医科大学附属医院临床中心实验室再次验证并予以完善。

材料：人胚肺成纤维细胞衰老模型。

端粒相关因子在人胚肺成纤维细胞复制性衰老过程中表达实验的主要试剂及仪器：

实验方法：

细胞培养：人胚肺成纤维细胞由北京军事医学科学院放射与辐射医学研究所分子生物学实验室建立。细胞用体积分数10%胎牛血清的DMEM培养基于体积分数5%CO₂的37 ℃培养箱中培养。

RT-PCR：根据端粒相关因子人端粒结合蛋白1、端锚聚合酶1、端粒酶RNA、端粒末端保护蛋白1-2及β-actin基因序列设计其PCR检定引物。

人端粒结合蛋白1(F:5’-GAA TAT TTG GTG ATC CAA ATT CTC ATA TGT-3’；R:5’-AGT TACC GCA GAC TGT TTG TCA CTA ACA CT-3’)；

端锚聚合酶1(F:5’-CCG GAG GGG GAT GGC AGT CGG GAT CCG CCC-3’；R:5’-CCG GCC GGC CAT GTC CTT TGC ATT TAC GTT-3’);

端粒酶RNA(F: 5’-CGA ACG GGC CAG CAG CTG ACA TT-3’；R:5’-GGG TGG TGG CCA TTT TTT GT-3’);

端粒末端保护蛋白1-2(F:5’-TTC AGA TGT TAT CTG TCA ATC AGA ACC TG-3’；R:5’-ATG TAT TGT TCC TTG TAT AAG AAA TGG TGC-3’)；

β-actin (F:5’-TTC AGG TTT ACT CAC GTC ATC C-3’；R:5’-CCA AAT GCG GCA TCT TCA AAC C-3’)。

以上引物序列由北京三博公司合成。

选择培养代龄为21，29，44，51，59(PD21，PD29，PD44，PD51，PD59)的人胚肺成纤维细胞，细胞融合达到90%时，用TRIzol法提取RNA。用所得到的不同代龄的人胚肺成纤维细胞RNA，采用Promega公司的ImProm-Ⅱ^TM Reverse Transcriptase进行反转录。得到cDNA后进行相关因子的PCR。

Western blot：选不同代龄的人胚肺成纤维细胞，裂解细胞提取蛋白并检测蛋白浓度。将样品进行8%SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。电泳结束后转膜。然后封闭膜2 h。加入一抗作用2 h，洗膜。再加入二抗作用2 h，洗膜。化学发光法检测目的蛋白的表达。

主要观察指标：通过PCR实验观察人端粒结合蛋白1、端锚聚合酶1、端粒末端保护蛋白1以及端粒酶RNA的表达情况；通过Western blot实验观察人端粒结合蛋白1、端锚聚合酶1、端粒末端保护蛋白1以及P53的蛋白表达情况。

讨论

端粒长度是控制细胞衰老的“分子钟”，端粒相关蛋白对端粒的长度具有调节作用^[29-31]。研究结果显示人端粒结合蛋白1可能通过多种途径发挥作用。“端粒长度调节的蛋白计数模型”(protein counting mechanism for telomere length regulation)认为端粒DNA结合的人端粒结合蛋白1达到一个临界数值时，便产生抑制端粒酶复合物活性的信号，端粒延伸终止；若染色体不完全复制、核酸外切酶降解或发生重组，导致端粒长度缩短，端粒结合的人端粒结合蛋白1也相应减少，当人端粒结合蛋白1减少到临界数值时，则重新激活端粒酶复合物，端粒长度再次延伸到特定长度。当端粒DNA结合的人端粒结合蛋白1又重新达到临界数值时，再次抑制端粒酶复合物的活性，从而维持了癌细胞端粒长度的稳定性。但是，关于在正常细胞复制性衰老过程中人端粒结合蛋白1的研究还没有报道。 Western blot检测结果显示人端粒结合蛋白1的蛋白表达量随着细胞的衰老而增加，但是RT-PCR检测结果显示人端粒结合蛋白1 mRNA表达水平随着细胞的衰老无明显变化。表明在细胞的衰老过程中对人端粒结合蛋白1的转录没有影响。文献报道，用蛋白合成抑制剂放线酮处理HT1080细胞(人成纤维肉瘤细胞)，检测人端粒结合蛋白1的半寿期，发现在肿瘤细胞内人端粒结合蛋白1的半寿期不到1 h，说明人端粒结合蛋白1在肿瘤细胞中存在的寿命较短，而且随着细胞的永生化程度增加人端粒结合蛋白1的蛋白表达量增加^[32-34]。文章研究结果显示人端粒结合蛋白1的蛋白表达量随着人胚肺成纤维细胞的衰老而增加。在正常细胞内，人端粒结合蛋白1的蛋白表达量伴随着细胞的衰老为什么会增加？人端粒结合蛋白1在细胞衰老与细胞永生化过程中都高表达的机制是一样的吗？这是一个十分值得探讨的问题。实验结果显示随着细胞的衰老，端粒逐渐缩短，同时在细胞衰老的早期伴随着人端粒结合蛋白1的蛋白表达量的增加，而在细胞衰老的晚期人端粒结合蛋白1却快速下降。人端粒结合蛋白1表达量的增加是否同肿瘤细胞一样有助于端粒长度的缩短？在衰老的晚期为什么会产生快速的下降？其作用还有待于深入探索。因此，这一现象的发现对研究人端粒结合蛋白1在正常细胞衰老中的作用具有重要意义。端锚聚合酶1是人端粒复合物中的一个重要组分，是一个由1 327个氨基酸残基构成的蛋白质，其中心区域含有24个锚蛋白(ankyrin)的重复区，C末端与聚腺苷二磷酸核糖基聚合酶的催化区域同源，因此具有聚腺苷二磷酸核糖基聚合酶活性。端锚聚合酶的聚腺苷二磷酸核糖基聚合酶活性作用的底物一个是人端粒结合蛋白1，另一个是端锚聚合酶自身。端锚聚合酶与人端粒结合蛋白1的作用是瞬时的，此时的人端粒结合蛋白1形成二聚体。体外重组表达的端锚聚合酶可使人端粒结合蛋白1核糖基化而丧失结合端粒DNA的能力，允许端粒酶结合端粒DNA，使端粒得以延伸^[35-36]。这表明在人细胞中，端粒的功能受聚腺苷二磷酸核糖基化的调节。实验结果显示，端锚聚合酶1的mRNA水平及蛋白表达水平并不随人胚肺成纤维细胞的衰老而变化。那么作为端锚聚合酶1底物的人端粒结合蛋白1在人胚肺细胞衰老过程中的先高表达和随后的低表达的蛋白的聚腺苷二磷酸核糖基化水平的变化可能对人胚肺细胞的衰老更具有意义。端粒末端保护蛋白1是至今发现的惟一与端粒DNA单链结合的蛋白，是维持端粒结构稳定所必需的^[37-39]。缺少端粒末端保护蛋白1的细胞会由于染色体末端的融合而死亡，这说明端粒末端保护蛋白1是确保染色体末端完整的管家基因。端粒末端保护蛋白1利用其寡核苷酸/寡糖聚合物结构形成2个突出的环卡在ssDNA上。端粒末端保护蛋白1与人端粒结合蛋白1之间通过端粒末端保护蛋白1-交互作用蛋白/端粒末端保护蛋白1，2连接蛋白复合物间接相互作用。人端粒结合蛋白1可能是通过这种相互作用将信息由双链DNA传递到单链DNA 3’突出端(overhang)的。过表达端粒末端保护蛋白1有利于招募端粒酶结合于端粒。实验中发现端粒末端保护蛋白1 mRNA随着人胚肺成纤维细胞的衰老表达水平逐渐降低，由于端粒末端保护蛋白1表达量的降低，影响端粒末端保护蛋白1与端粒突出端ssDNA的结合能力，使端粒末端保护蛋白1不足以与ssDNA结合，导致了端粒末端结构的破坏，加速了细胞的衰老。此外，端粒末端保护蛋白1表达量的下降势必影响端粒末端保护蛋白1与人端粒结合蛋白1之间通过端粒末端保护蛋白1-交互作用蛋白/端粒末端保护蛋白1，2连接蛋白复合物间接相互作用，进而影响端粒的稳定性。因此，进一步研究端粒末端保护蛋白1在细胞衰老中的表达调控机制有可能更全面揭示端粒末端保护蛋白1在人胚肺成纤维细胞衰老过程中的作用。以往对端粒酶的研究，重点集中在端粒酶催化亚基，现有线索表明端粒酶RNA同样非常重要。端粒酶RNA是端粒酶的组成成分，它在肿瘤细胞和正常细胞中都有表达。端粒酶RNA二级结构复杂，而它作为分子相互作用的识别位点和结合位点对其生物功能的实现具有重要决定作用。有研究报道，在分裂间期正常细胞内会短暂的表达端粒酶活性，但不能够阻止细胞衰老。端粒酶RNA在正常细胞中广泛表达，端粒酶RNA可以与端粒相关蛋白核内不均一核糖核蛋白结合，由此表明端粒酶RNA很可能也参与细胞的衰老过程。我们通过检测衰老过程中不同代龄的人胚肺成纤维细胞端粒酶RNA的RNA表达水平，发现其mRNA水平随着细胞的衰老呈递增趋势。表明端粒酶RNA可能也参与细胞的衰老过程，而且很有可能是通过非端粒酶途径，与其他细胞内蛋白相互作用而发挥作用。这为全面研究端粒酶RNA在正常细胞中广泛表达的作用机制研究提供了线索。研究发现在衰老细胞中的p53的磷酸化水平较年轻细胞中高，且与p21的表达水平正相关^[40-42]。而在正常细胞衰老过程中p53的表达水平是否也发生变化并无报道，因此作者检测了不同代龄的人胚肺成纤维细胞中P53的蛋白表达水平，结果表明不同代龄的人胚肺成纤维细胞中P53蛋白表达量没有变化。那么在细胞衰老过程中P53的磷酸化水平是否发生变化就非常值得关注了。综上所述，复制性衰老与端粒相关因子密切相关，其中人端粒结合蛋白1、端粒末端保护蛋白1、端锚聚合酶1可能是衰老过程的管家基因，它们在衰老过程中的变化可能是引发衰老的根本原因。此外，端粒酶RNA在正常细胞中大量表达，存在既是合理的，那么端粒酶RNA在衰老过程起什么作用呢？检测细胞衰老过程中端粒酶RNA的表达差异，将可能确定端粒酶RNA是否也参与衰老过程并在其中起重要作用。以往有关端粒相关因子的相互作用，以及与端粒的变化关系多是以肿瘤细胞为研究对象获得的，这些相关因子在正常细胞衰老中的表达变化还不十分清楚。为此，文章以人胚肺成纤维细胞复制性衰老模型为观察对象，以端粒相关因子人端粒结合蛋白1、端粒末端保护蛋白1、端锚聚合酶1、端粒酶RNA为研究分子，探讨它们在细胞复制性衰老过程中的表达变化，进而揭示其与细胞复制性衰老的关系。

人胚肺成纤维细胞复制性衰老过程中端粒相关因子的表达

Telomere-associated factor expression in replicative senescence of human embryonic lung fibroblasts

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